18/05/2022
Door Ad Spijkers
Met de PlasmidMaker kunnen onderzoekers het perfecte plasmide voor hun behoeften visualiseren en samenstellen.
Een plasmide is een cirkelvormige streng DNA die zich buiten het chromosomaal DNA bevindt van sommige eencellige organismen. Met dit DNA kan genetische informatie tussen bacteriën, ook tussen soorten, worden uitgewisseld. Via plasmiden worden vaak eigenschappen overgedragen die bijdragen aan de overleving van het organisme, bijvoorbeeld resistentie tegen antibiotica.
Plasmiden worden veelvuldig gebruikt in de basis- en toegepaste biologie. Wetenschappers gebruiken de kleine moleculen om nieuwe genen in een doelorganisme te introduceren. Plasmiden zijn bekend om hun toepassingen bij de productie van therapeutische eiwitten zoals insuline. Ze worden plasmiden op grote schaal gebruikt bij de grootschalige productie van veel bioproducten. Het ontwerpen en bouwen van plasmiden blijft echter een van de meest tijdrovende en arbeidsintensieve stappen in biologieonderzoek.
PlasmidMaker
Om dit aan te pakken, hebben onderzoekers van het Center for Advanced Bioenergy and Bioproducts Innovation (CABBI) van de University of Illinois in Urbana-Chapaign (Illinois) een veelzijdig en geautomatiseerd platform ontwikkeld voor het ontwerpen en bouwen van plasmiden, PlasmidMaker genaamd.
Het maken van een plasmide begint bij het ontwerp. Om dit ontwerpproces te ondersteunen, heeft PlasmidMaker een gebruiksvriendelijke webinterface waarmee onderzoekers intuïtief het juiste plasmide voor hun behoeften kunnen visualiseren en samenstellen. Zodra het plasmide is ontworpen, wordt het ingediend bij het PlasmidMaker-team en wordt een bestelling voor het plasmide geplaatst bij de Illinois Biological Foundry for Advanced Biomanufacturing (iBioFAB), waar het plasmide zal worden gebouwd.
Dit onderdeel van de University of Illionis heeft een volledig geïntegreerde computer- en fysieke infrastructuur die snelle fabricage, kwaliteitscontrole en analyse van genetische constructies ondersteunt. Het beschikt over een centrale robotarm die laboratoriumbenodigdheden overbrengt tussen instrumenten die verschillende bewerkingen uitvoeren, zoals pipetteren, incubatie of thermocycling.
Geautomatiseerd proces
Het proces voor het bouwen van plasmiden is geautomatiseerd. Monsters worden bereid door middel van polymerasekettingreactie en zuivering, de DNA-sequentie wordt geassembleerd en getransformeerd en de plasmiden worden bevestigd en ingevroren, allemaal met weinig menselijke tussenkomst.
Behalve de automatisering en precisie die wordt geboden door iBioFAB, pioniert het PlasmidMaker-platform ook met een flexibele methode voor het samenstellen van meerdere DNA-fragmenten in een plasmide. Dit gebeurt met behulp van op het Pyrococcus furiosus Argonaute (PfAgo) eiwit gebaseerde kunstmatige restrictie-enzymen.
Restrictie-enzymen
Dergelijke enzymen worden al lang gebruikt bij de constructie van plasmiden, omdat ze DNA-moleculen kunnen splitsen op specifieke sequenties van basen, herkenningssequenties genoemd. Deze sequenties zijn echter meestal kort, waardoor het moeilijk is om ermee te werken. Een korte sequentie zal waarschijnlijk meerdere keren voorkomen in een DNA-molecuul, in welk geval het restrictie-enzym te veel sneden zou maken.
Bij eerdere DNA-assemblagemethoden was het vaak moeilijk om de juiste restrictie-enzymen te vinden die het plasmide kunnen knippen en de DNA-fragmenten kunnen vervangen. De op PfAgo gebaseerde kunstmatige restrictie-enzymen bieden meer flexibiliteit en precisie, omdat ze kunnen worden geprogrammeerd om op vrijwel elke locatie langere herkenningssequenties te zoeken.
Met alle verbeteringen die het met zich meebrengt, hopen de teamleden van CABBI dat PlasmidMaker de ontwikkeling van synthetische biologie voor biotechnologische toepassingen zal versnellen. Deze tool zal beschikbaar zijn voor CABBI-onderzoekers en uiteindelijk voor andere onderzoekers.
Foto: CABBI